restriksjonskartlegging dobbelt fordøyelsesproblem

1. Hvorfor er det dobbelt fordøyelsesbegrensninger?
2. Hvorfor fungerer ikke begrensningsfordøyelsen min?
3. Hva skjer hvis du legger til for mye restriksjonsenzym?
4. Kan to restriksjonsenzymer skjære på samme sted?
5. Hvordan beregner du restriksjonsfordøyelse?
6. Hvor lang tid bør en restriksjonsfordøyelse ta?
7. Er varmeinaktivering av restriksjonsenzymer nødvendig?
8. Gjør restriksjonsenzymer utløp?
9. Hvordan kan restriksjonsfordøyelse forhindres?
10. Hvorfor vil ikke et restriksjonsenzym kutte?
11. Hvordan velger du restriksjonsenzymer?
12. Hvorfor må restriksjonsenzymer holdes på is?

Hvorfor er det dobbelt fordøyelsesbegrensninger?

Fordøyelse av et DNA-substrat med to restriksjonsendonukleaser samtidig (dobbel fordøyelse) er en vanlig tidsbesparende prosedyre. Å velge den beste NEBufferen for å gi reaksjonsbetingelser som optimaliserer enzymaktivitet i tillegg til å unngå stjerneaktivitet assosiert med noen enzymer er en viktig faktor..

Hvorfor fungerer ikke begrensningsfordøyelsen min?

Ufullstendig eller ingen fordøyelse på grunn av enzymaktivitet blokkert av DNA-metylering. Hvis enzymet ditt er aktivt og fordøyer kontroll-DNA og reaksjonen er satt opp under optimale forhold, men du fremdeles ser problemer med fordøyelsen, kan det være fordi enzymet hemmer ved metylering av mal-DNA..

Hva skjer hvis du legger til for mye restriksjonsenzym?

Ufullstendig fordøyelse kan oppstå når det brukes for mye eller for lite enzym. Tilstedeværelsen av forurensninger i DNA-prøven kan hemme enzymene, og også resultere i ufullstendig fordøyelse.

Kan to restriksjonsenzymer skjære på samme sted?

Du kan gjøre med riktige kontroller som fordøyelse av enkelt begrensning og begge enzymene sammen for å sikre at begge kutter uavhengig og sammen også, og fortsett med planene dine. Dessverre var jeg begrenset til disse to enzymene som tilfeldigvis hadde steder ved siden av hverandre!

Hvordan beregner du restriksjonsfordøyelse?

Beregn mengden av hver du trenger for å legge til en restriksjonsfordøyelse for å fordøye 5ug (5000ng) DNA med 5 enheter enzym. For eksempel hvis DNA'et mitt er 190 ng / ul, trenger jeg: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul av prøven min.

Hvor lang tid bør en restriksjonsfordøyelse ta?

* Pro-Tips * Avhengig av applikasjonen og mengden DNA i reaksjonen, kan inkubasjonstiden variere fra 45 minutter til over natten. For diagnostiske fordøyelser er ofte 1-2 timer tilstrekkelig. For fordøyelser med >1 µg DNA brukt til kloning, anbefales det at du fordøyer i minst 4 timer.

Er varmeinaktivering av restriksjonsenzymer nødvendig?

FAQ: Er det nødvendig å inaktivere restriksjonsenzymer etter vektorfordøyelse? Inaktivering av restriksjonsendonukleaser er vanligvis ikke nødvendig, men i noen tilfeller kan det øke transformasjonseffektiviteten.

Utløper restriksjonsenzymer?

Alle enzymer analyseres for aktivitet hver 3.-6. Måned; utløpsdatoen er angitt på etiketten som er festet til hvert hetteglass med enzym. Etter trettiifem års erfaring med restriksjonsenzymer, har vi funnet at de fleste er veldig stabile når de lagres ved -20 ° C i anbefalt lagringsbuffer..

Hvordan kan restriksjonsfordøyelse forhindres?

Restriksjonsenzymfordøyelsesprotokoll

1. Legg komponenter til et rent rør i den viste rekkefølgen: ...
2. Inkuber reaksjonen ved fordøyelsestemperatur (vanligvis 37 ° C) i 1 time.
3. Stopp fordøyelsen ved varmeinaktivering (65 ° C i 15 minutter) eller tilsetning av 10 mM sluttkonsentrasjon EDTA.
4. Det fordøyde DNAet er klart til bruk i forskningsapplikasjoner.

Hvorfor ville ikke et restriksjonsenzym kutte?

FAQ: Hvorfor kutter ikke begrensningsenzymet mitt DNA? ... Hvis kontroll-DNA er spaltet og eksperimentelt DNA motstår spaltning, kan de to DNAene blandes for å bestemme om en hemmer er tilstede i eksperimentprøven. Hvis en hemmer (ofte salt, EDTA eller fenol) er tilstede, vil ikke kontroll-DNA kutte etter blanding.

Hvordan velger du restriksjonsenzymer?

Når du velger begrensningsenzymer, vil du velge enzymer som:

1. Flank innsatsen, men ikke skjær i innsatsen.
2. Er på ønsket sted i mottakerplasmidet ditt (vanligvis i Multiple Cloning Site (MCS)), men ikke kutt andre steder på plasmidet.

Hvorfor må restriksjonsenzymer holdes på is?

Må enzymer virkelig holdes på is hele tiden? ... Enzymer må lagres og brukes ved de optimale temperaturene. Enzymer lagres vanligvis i glyserol ved -20 ° C. Dette forhindrer dem i å fryse helt, noe som forårsaker proteindenaturering og resulterer i tap av aktivitet.